Etude Des Mécanismes D'assemblage de La Chaperone Hsp90/r2tp

**Etude des mécanismes d'assemblage de la chaperone HSP90/R2TP // Mechanisms of Macromolecular Complex Assembly by the Chaperone HSP90/R2TP**:

- Réf **ABG-130862**
**ADUM-64543**
- Sujet de Thèse
- 11/04/2025
- Contrat doctoral
- Université de Montpellier
- Lieu de travail- Montpellier CEDEX 5 - France
- Intitulé du sujet- Etude des mécanismes d'assemblage de la chaperone HSP90/R2TP // Mechanisms of Macromolecular Complex Assembly by the Chaperone HSP90/R2TP
- Mots clés- Chaperone HSP90/R2TP, protéomique quantitative, assemblage de complexes macromoléculaires, stress nutritionnel, homéostasie protéique
HSP90/R2TP chaperone, quantitative proteomics, assembly of macromolecular complexes, nutrient stress, proteostasis

**Description du sujet**:

- L'homéostasie protéique repose sur l'équilibre entre la synthèse des protéines, leur repliement correct et leur dégradation, processus qui sont régulés de façon coordonnée par l'ensemble des facteurs impliqués dans le Contrôle Qualité des Protéines (PQC). Notre équipe a montré, avec d'autres, que la co-chaperone R2TP, associée à HSP90, joue un rôle essentiel et unique dans l'homéostasie protéique en assurant l'assemblage ordonné de complexes macromoléculaires, qu'il s'agisse de particules ribonucléoprotéiques (RNPs), telles que les sn/snoRNPs ou les miRNPs, ou de machineries multiprotéiques, telles que les ARN polymérases ou les PIKKs (1,2). Ces complexes macromoléculaires, qui sont appelés « clients » d'HSP90/R2TP, sont des acteurs essentiels de la prolifération et de la croissance cellulaires (3,4). En accord avec ces données, les membres du complexe HSP90/R2TP sont surexprimés dans de nombreux cancers et sont requis pour la tumorigenèse chez la souris (5).

La manière dont les différentes sous-unités des complexes clients sont recrutées par le R2TP, dans quel ordre, à quel endroit, et le mécanisme d'assemblage lui-même, ne sont pas bien compris. Le projet de thèse a pour but de détailler les mécanismes d'assemblage des clients de la chaperone HSP90/R2TP et s'articule autour de 4 axes principaux:
(i) Caractériser de façon systématique les différents intermédiaires d'assemblage par DIP-MS (Deep Interactome Profiling by Mass Spectrometry), une approche qui combine l'immunoprécipitation du R2TP, suivie de la séparation des sous-complexes partenaires sur gel natif et l'identification par spectrométrie de masse des protéines présentes dans chaque sous-complexe. Ces expériences seront réalisées dans des conditions qui bloquent l'assemblage des clients du R2TP à différentes étapes, par exemple en inhibant son activité ATPase par une drogue (5) ou en induisant sa dégradation ponctuelle avec un système dTAG (déjà disponible dans l'équipe).

(ii) Une approche complémentaire, plutôt que d'inhiber l'activité du R2TP lui-même, sera de muter sur les clients les sites de liaison du R2TP, notamment les sites DSDD/E phosphorylés connus pour interagir avec PIH1D1, l'un des membres du R2TP. L'effet de ces mutations sur l'interaction de ces sous-unités clientes avec le R2TP et leur assemblage avec leurs partenaires sera analysé par différentes approches (notamment AP-MS classique et DIP-MS, comme en (i)).

(iii) Caractériser les interactions identifiées au sein des sous-complexes d'assemblage par double hybride et par une approche innovante de cross-link in vivo couplé à l'analyse par spectrométrie de masse des peptides crosslinkés. Ceci permettra d'évaluer l'architecture moléculaire des complexes intermédiaires d'assemblage. Des modèles 3D de ces complexes seront obtenus par Alphafold et testés par mutagenèse. Ceci éclaircira les mécanismes d'assemblage utilisés par le R2TP.

(iv) Explorer le rôle du R2TP et la dynamique d'assemblage de ses clients en condition de reprogrammation traductionnelle comme lors d'un stress nutritionnel. L'étudiant.e en thèse analysera en particulier les nombreux clients du R2TP jouant un rôle dans la croissance cellulaire via leur action essentielle dans la transcription, la maturation des ARN et la biogenèse des ribosomes.

Les résultats obtenus devraient éclaircir le mode de recrutement et les mécanismes d'assemblage des complexes clients de la chaperone HSP90/R2TP. Ils permettront également de mieux comprendre comment le processus d'assemblage de ses clients est coordonné et régulé dans différentes conditions de croissance cellulaire, et contribue à une prolifération cellulaire normale et pathologique.

Cellular protein homeostasis (= proteostasis) is based on the balance between protein synthesis, folding and degradation, processes that are regulated in a coordinated manner by all the factors involved in Protein Quality Control (PQC). Among others, our team has shown that the co-chaperone R2TP, associated with HSP90, plays an essential role and unique role in proteostasis by ensuring the orderly assembly of macromolecular complexes, either ribonucleoprotein particles (RNPs), such as sn/snoRNPs, or multiprotein machineries, such as RNA polymerases or