Stage : Développement D'un Système Microfluidique

La résistance bactérienne aux traitements thérapeutiques représente une menace croissante pour la santé humaine et animale dans le monde entier. En Europe, elle est responsable d'environ 25 000 décès par an et les coûts associés sont estimés à quelque 1,5 milliard d'euros par an. De nouvelles formes de résistance apparaissent et se propagent, laissant aux cliniciens peu d'options pour le traitement des infections. En dépit de la demande en développement de nouveaux composés antimicrobiens, seules deux nouvelles classes d'antibiotiques ont été introduites sur le marché au cours des trois dernières décennies. Sur le plan scientifique, il est urgent de mieux comprendre le fonctionnement des antibiotiques, le développement de la résistance et les mécanismes moléculaires qui pourraient être exploités pour détourner la résistance bactérienne. Le programme de recherche européen IMI-TRANSLOCATION visait à mieux comprendre le transport et l'accumulation d’antibiotiques, ainsi que l'émergence de la multirésistance chez les bactéries Gram-négatives problématiques du groupe pathogène ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.). Des résultats significatifs ont été obtenus concernant (i) la translocation des antibiotiques à travers les porines de la membrane externe, et (ii) l'impact des pompes d'efflux sur l'accumulation et l'activité des antibiotiques chez les entérobactéries.

Objectifs scientifiques:
Depuis plusieurs années, la collaboration entre le laboratoire MCT d'Aix-Marseille Univ., et la ligne DISCO de SOLEIL, a permis de développer la méthode KMSF (Kinetic-MicroSpectroFluorimetry) pour quantifier l'accumulation d'antibiotiques dans des bactéries isolées _in vivo_. Cependant, cette méthodologie présente deux limitations majeures : (i) le dépôt des bactéries entre deux lamelles de quartz n'empêche pas leur mobilité; (ii) l'exposition des bactéries aux antibiotiques hors du microscope ne permet pas l'enregistrement du signal de fluorescence dès le début de l'expérience. Nous pensons que le couplage de l’imagerie UV à haute résolution avec un dispositif microfluidique adapté permettrait de lever ces limitations.

L'immobilisation des cellules bactériennes constitue un obstacle technique majeur à la mise en œuvre d'approches unicellulaires pour l'imagerie à haute résolution. Le traitement des lamelles de microscope par des molécules adhésives est une solution potentielle pour immobiliser les cellules bactériennes, mais les polymères cationiques traditionnels, tels que la poly-lysine (PLL), affectent profondément la physiologie bactérienne.

Nous avons commencé à prototyper un dispositif microfluidique (MF) avec le MF-Lab de SOLEIL en nous basant sur des modèles trouvés dans la littérature (figure ci-contre). Il est composé de deux entrées (pour l'injection de l'antibiotique ou de l'adjuvant), d'un canal principal (pour l'injection des bactéries) et d'une sortie.

Le premier objectif de ce stage sera de caractériser différentes stratégies chimiques pour leur (bio)compatibilité lorsqu'elles sont adsorbées sur des lamelles de quartz pour immobiliser des cellules d'Escherichia coli.

Nous avons identifié plusieurs substrats de la famille des organosilanes disponibles dans le commerce (i.e., APTES: 3-aminopropyltriéthoxysilane, APTMS: 3-aminopropyltriméthoxysilane, GPTS: glycidoxypropyltriéthoxysilane, ODMCS: octyldiméthylchlorosilane, OTS: octadécyltricholorosilane, et EDS: N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyltriméthoxysilane) ainsi que des réactifs commerciaux (à savoir Vectabond®, CellTack et Polysin) qui pourraient être utilisés pour revêtir des lamelles en quartz.

La fluorescence résultante des différents substrats devra être testée dans la gamme d'UV utilisée à DISCO. Ensuite, la survie et l'attachement des bactéries devront être évalués. Les bactéries seront imagées immédiatement après leur immobilisation pendant 30 minutes. La mort cellulaire devra être évaluée à l'aide d'une coloration au l'iodure de propidium pour marquer les cellules mortes. Des méthodes de suivi temporel individuel des bactéries devront être développées sur la ligne DISCO afin d'étudier la transition vers un attachement irréversible (différent du retournement, de la rotation ou du détachement des bactéries). Nous espérons ainsi identifier un substrat (bio)compatible qui améliorera le taux de dépôt des bactéries.

Des essais d'accumulation de ciprofloxacine, un antibiotique bien caractérisé de la famille des fluoroquinolones (voir l'organigramme ci-dessous), seront réalisés avec des souches d'E. coli AG100 (type sauvage), AG100A (efflux de médicaments défectueux).

Les médicaments antibactériens sont de petites molécules. Pour comprendre leurs efficacités, il est nécessaire de comprendre leur interacti